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經實驗優化，最終確定甲醇/甲苯/甲酸（70:30:1）為理想溶劑體系。DESI/PI 技術創新的光后電離增強機制顯著提升了多種中性物質的成像清晰度，正離子模式下成功呈現了包括 GABA、谷氨酰胺、谷氨酸、肌酸及腺苷等在內的神經遞質分布特征（圖 1B-E）。以肌酸為例，其信號強度最高可增強達200倍。此外，研究還觀察到小腦和胼胝體白質中存在十余種非極性脂質，如豐富的膽固醇以及鞘糖脂 GalCerr（見圖1J和N-P)。這些發現表明，DESI/PI 技術能夠實現神經遞質與脂質的同步成像，為解析二者之間的相互作用機制提供了有力支持。
圖1 通過DESI/PI和DESI分別對全腦組織切片進行平均正離子質譜分析，部分代表性物質的成像結果。
通過DESI/PI雙模式切換，在負離子模式下分別獲得了DESI質譜圖和DESI/PI質譜圖。研究表明，兩種模式的譜圖信息具有互補性。DESI/PI模式在成像谷氨酰胺（圖2B）、谷氨酸（圖2C）以及己糖基神經酰胺（HexCer）（圖2I）等中性成分的同時，也顯著提升了醚磷脂（PE-O）和磷脂酰乙醇胺（PE）脂質（圖2E-H）的離子信號檢測（2-4倍）。然而，對于磷脂酰肌醇（PI）和硫苷脂（ST）類脂質（如PI(38:4)（圖2K）及ST(d18:1/C24:1)（圖2L)），DESI模式獲得的離子強度明顯高于DESI/PI模式。推測這些離子信號的衰減可能與負離子同光后電離過程產生的正甲苯離子發生結合有關。盡管如此，DESI/PI模式在檢測多數代謝物和脂質類別時仍展現出更高的靈敏度。通過兩種模式的靈活切換，可以實現樣品中多種生物分子信息的完整獲取，為全面解析其分布與相互作用提供有力支持。
圖2 通過DESI/PI和DESI負離子模式采集的腦組織切片的平均質譜圖(A)，圖（C-M）呈現了代表性峰的質譜圖像。
DESI/PI技術的另一重要應用在于同步可視化植物組織中的極性與非極性代謝物空間分布。本研究選取富含多種生物活性成分（如兒茶素）的鮮茶葉芽橫截面為樣本，在DESI/PI模式下，咖啡因信號強度顯著提升達200倍。此外， DESI/PI技術成功實現了多種中性兒茶素類黃烷-3-醇的檢測與成像，包括（-）表兒茶素（EC）、（-）表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和（-）表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。由于ECG和EGCG的熱不穩定性，其檢測主要基于特征碎片離子（ECG: m/z 272.07; EGCG: m/z 289.07）。這些結果有力證明，DESI/PI技術能夠有效克服低極性化合物（如兒茶素）在常規DESI中離子化效率低的問題，為全面解析植物復雜代謝物的空間分布提供了強大工具。
圖3 茶樹兩個連續新鮮葉芽橫截面的平均質譜圖，（B-F）DESI/PI 獲得的代表性峰的質譜圖像。（G-H）DESI獲得的代表性峰的質譜圖像。
中國科學技術大學國家同步輻射實驗室潘洋團隊在《Talanta》期刊發表題為“Cholesterol was identified as a biomarker in human melanocytic nevi using DESI and DESI/PI mass spectrometry imaging”的研究論文，采用解吸電噴霧光后電離（DESI/PI）技術，建立了一種原位跨極性檢測的空間代謝組學方法，顯著提升了非極性脂質在黑素細胞痣組織中的檢出。能在分子層面更精準地區分健康正常組織與黑素細胞痣。結合多變量統計分析及免疫組化檢測，進一步證實膽固醇是診斷黑素細胞痣的潛在生物標志物。（文章鏈接： https://doi.org/10.1016/j.talanta.2021.122380）
黑色素細胞痣是最人類常見的良性皮膚病變，由于其顯著增加患者罹患惡性黑色素瘤風險，需手術切除。然而，現有治療手段（激光治療、手術）面臨復發挑戰，根源在于術中難以實時確認是否徹底清除病灶。現有診斷方法存在明顯不足：金標準的組織病理學高度依賴經驗且難區分良惡性；影像學技術（皮膚鏡等）靈敏度/特異性有限，缺乏分子層面的精準識別能力。質譜成像（MSI）技術，特別是無需基質操作便捷的解吸電噴霧電離（DESI），能提供分子空間分布信息，但存在關鍵局限：對生物樣本中關鍵的非極性化合物（如膽固醇、脂質）電離效率較低，限制了全面分析。為突破此瓶頸，本研究引入創新的解吸電噴霧電離/后光離子化（DESI/PI ）技術。該技術通過后光離子化組件對DESI脫附物進行高效二次電離，顯著提升非極性物信號強度，實現對極性與非極性成分的同步、全面成像分析，為術中實時精準切除、降低復發風險提供強大的分子診斷新工具。
收集九例不同部位黑色素細胞痣術中標本，制成冰凍組織切片。采用解吸電噴霧光后電離質譜成像技術（DESI/PI-MSI），采集上述組織中內源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進行HE染色，采用MassImager質譜成像數據處理軟件，使質譜成像圖與HE染色圖匹配重合，提取不同組織內源性代謝物輪廓信息。對采集數據進行PCA分析，同時采用免疫組化方法檢測膽固醇相關蛋白表達，揭示膽固醇在黑色素瘤組織聚集原因。
基于DESI/PI光后電離增強非極性物質電離效率的技術優勢，本研究檢測到大量非極性成分的質譜信號。通過雙模式切換生成互補質譜圖像，成功鑒定并可視化了多達118種分子（正離子模式下64種，負離子模式下54種），并獲得黑色素細胞痣與正常組織中極性物質和非極性物質的代表性質譜峰。實驗中直觀呈現多種生物標志物的區域特異性分布信息（圖1C-P)。例如，L-肉堿、S1P、膽固醇、PC34：1和PC38：4主要分布在痣區，而TG54：6、利多卡因及其他生化物質則在正常區域占主導地位。S1P、膽固醇、PC34：1和PC38：4 等物質的空間分布特征與H&E染色圖像高度吻合（圖1B)，且具有統計學顯著差異（P < 0.0001）。
圖1 (A)黑色素細胞痣組織與正常組織在正離子模式下的區域特異性質譜圖。DESI/PI（紅色曲線）與 DESI（黑色曲線）的平均質譜圖疊加顯示。(B)樣本組織的H&E染色圖像，（C-K）主要分布于黑色素細胞 痣的脂質質譜圖像。（L-O）正常組織中脂質分布的質譜圖像，以及(P)利多卡因的質譜圖像
通過分析九份臨床標本，本研究提取了黑色素細胞痣與正常組織的質譜數據集（m/z 250-950）。通過二維主成分分析（PC1和PC2）可清晰區分九份臨床人體皮膚組織中的黑色素細胞痣與正常組織。前兩個主成分分別解釋了65%和10%的方差。圖2B展示了前兩個主成分的載荷數據散點圖，以識別區分黑色素細胞痣與正常組織的關鍵變量。負載PC1的物種（m/z 339.24、339.28、577.52和603.53）主要分布于正常組織中，而正載PC1的變量則代表在黑色素細胞痣中更為豐富的物種。位于m/z 369.35附近的變量源自膽固醇，其在PC1上的正載值最高，表明膽固醇是黑色素細胞痣中最重要的生物標志物之一。
圖2 標本1樣本載玻片中黑色素細胞痣和正常組織區域的S1P (A)、膽固醇(B)、PC 34：1 (C)、PC 38：4 (D)、花生四烯酸(E)和PE O-36：5 (F)的箱形圖
為了解膽固醇在黑素細胞痣組織中積累的原因，研究選取了兩種與膽固醇密切相關的酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）和轉運蛋白（TSPO）作為染色觀察指標。HMGCR作為膽固醇生物合成的關鍵限速酶，通過下調HMGCR基因表達來調控膽固醇合成。TSPO是轉運蛋白，在膽固醇向線粒體的轉運過程中發揮重要作用，并且該蛋白還參與類固醇生物合成的調控。研究結果顯示，黑色素細胞痣中HMGCR（圖3C)和TSPO（圖3D)的表達水平顯著高于正常組織，這與質譜圖像中膽固醇的分布情況高度吻合。因此，推測黑色素細胞痣區域膽固醇蓄積的原因可能是：HMGCR酶合成更多膽固醇后，通過TSPO酶轉運至線粒體促進黑色素細胞增殖（圖3E)。雖然膽固醇在調控人類黑色素細胞生成中的作用尚不明確，但其可作為術中診斷黑色素細胞痣的生物標志物。
圖3 樣本1中膽固醇生物合成與轉運過程中膽固醇及酶的原位可視化。(A)膽固醇的質譜圖像。(B)組織切片的H&E染色圖像。(C)黑色素細胞痣與正常組織區域中HMG-CoA還原酶的表達情況。(D) TSPO在黑色素細胞痣與正常組織中的表達情況。(E)黑色素細胞膽固醇蓄積的簡易機制示意圖。
本研究采用DESI/PI質譜成像技術，對常規手術中采集的九例人體標本進行極性/非極性脂質綜合成像分析，旨在明確正常組織中的黑色素細胞痣特征并尋找潛在脂質生物標志物，通過DESI/PI和DESI雙模式切換，成功可視化多種脂質成分，并發現膽固醇、鞘氨醇一磷酸（S1P）、磷脂酰膽堿 （PCs）、磷脂酰乙醇胺（PE）、脂肪酸（FAs）、甘油三酯（MAGs）及二酰甘油（DAGs）等特定脂質可有效區分黑色素細胞痣與正常組織。通過箱線圖和雙尾t檢驗分析，這些脂質在黑色素細胞痣與正常組織中均呈現統計學顯著差異。對多例標本數據進行主成分分析（PCA）后發現，膽固醇是黑色素細胞痣中最顯著的生物標志物。免疫組化染色顯示，HMGCR和TSPO這兩種顯著上調的酶促反應，合理解釋了膽固醇的富集現象。本研究證實，DESI/PI質譜成像技術在皮膚病變及黑色素瘤等疾病的術中診斷中具有重要價值。
中國科學技術大學國家同步輻射實驗室潘洋團隊在分析化學一區《Analytical Chemistry》期刊發表封面文章，題為“Enhanced Coverage and Sensitivity of Imprint DESI Mass Spectrometry Imaging for Plant Leaf Metabolites by Post photoionization”，首創PTFE印跡-DESI/PI聯用技術，實現植物代謝物跨極性原位同步成像，成功解析萜類、兒茶素和內酯類非極性化合物空間動態，為植物代謝研究提供高靈敏、多極性覆蓋的分析新范式。（文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03329）
植物作為食品制藥領域的關鍵資源，其代謝物的譜型分析與空間定位對闡明生物合成、生理調控及環境互作機制至關重要。然而植物代謝物成像卻面臨三重技術壁壘：角質層和表皮蠟的屏障天然阻隔軟電離技術（MALDI/DESI）導致深層代謝物捕獲失敗；傳統穿透方案中激光燒蝕造成大部分熱敏物質降解，而化學預處理（氯仿清洗）破壞空間真實性并誘發褐變；即使改良溶劑體系，對葉片代謝物仍存在漏檢，且DESI對非極性物電離效率較低。本研究通過PTFE轉印-DESI/PI聯用技術實現雙重突破——多孔惰性介質完整轉移代謝物規避角質屏障，光后電離使中性分子信號提升百倍級，最終同步捕獲紫杉醇等非極性物與兒茶素生物合成網絡空間圖譜，為植物代謝通路研究提供有力支持。
收集綠茶、鼠尾草葉和銀杏葉三種植物樣本，采用多孔聚四氟乙烯（PTFE）片進行壓印處理并光學成像，采用DESI/PI裝置對樣本進行數據采集，原始數據經MSiReader軟件整合為離子分布圖像。化合物通過精確質荷比（誤差<10ppm）、同位素分布及串聯質譜鑒定，對比人類代謝組及脂質數據庫完成歸屬，基于KEGG京都基因與基因組百科全書和Metabo Analyst解析生物合成途徑。
鼠尾草屬植物富含具有顯著生物活性（如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化）的萜類化合物。DESI/PI的光后電離機制顯著增強了此類物質的檢測靈敏度。正離子模式下，該技術不僅基本覆蓋了DESI可檢出的化合物譜系，更額外識別并成像了14種已鑒定代謝物（圖1B）。其中，二萜類化合物卡諾醇、卡諾酸及表異松醇/異松醇廣泛分布于葉片（葉脈除外）；而具有抗癌、抗炎特性的三萜類物質熊果酸/齊墩果酸則富集于葉緣區域；中性脂質DAG（36：1）主要定位于葉脈。在負離子模式下，DESI/PI對相同質譜峰的檢測靈敏度較DESI提升了20至40倍。 綜上，本研究證明DESI/PI質譜成像系統作為一種高靈敏度技術，在正負離子模式下均能高效捕獲多種植物代謝物的空間分布信息。
圖1 (A)鼠尾草葉片經DESI/PI印跡法（紅色）和DESI印跡法（黑色）檢測的平均正離子質譜圖（背景扣除）。(B)DESI/PI印跡法與DESI正離子模式下檢測化合物的維恩圖。(C)鼠尾草葉片中部分代表性化合物經DESI/PI印跡法與DESI檢測的質譜圖像。
銀杏葉中產生多種具有顯著藥理活性的生物活性代謝物，其提取物有潛力治療與阿爾茨海默病、中風和正常衰老相關的某些神經系統后遺癥。如圖2A所示，通過印跡DESI/PI技術對銀杏葉進行平均質譜分析時，其光后電離機制成功捕獲谷氨酸、乙氧基香豆素及山柰酚/木犀草素等11類DESI完全漏檢的關鍵代謝物（包括黃酮類與萜內酯），同時將膽堿等共有化合物的檢測靈敏度提升10–20倍。空間分布解析層面，DESI/PI精準揭示黃酮類物質在葉片上部的梯度富集與葉柄處的最低蓄積規律，并鎖定銀杏內酯C17:1等生物活性烷基酚類在分泌腔的特異點狀分布——該分布模式與葉肉組織中均勻擴散的黃酮苷形成鮮明互補，從分子層面驗證植物次生代謝產物的細胞區室化存儲機制。技術性能上，負離子模式下DESI/PI對銀杏內酯的響應強度系統性提高10–20倍，并同步實現極性黃酮苷與非極性萜內酯的原位跨極性成像，徹底突破傳統DESI的檢測盲區與電離偏好限制，為解析植物代謝網絡的空間異質性提供強大的工具支撐。
圖2 (A)通過印跡DESI/PI（紅色）和DESI（黑色）檢測的銀杏葉正離子質譜平均圖（背景扣除）。(B)印跡DESI/PI與DESI在正離子模式下檢測化合物的維恩圖。(C)銀杏葉中部分代表性化合物的印跡DESI/PI與DESI質譜圖像。(D)m/z 287.06（紅色）和m/z 375.29（綠色）處離子的RGB共定位圖像。
DESI/PI技術在綠茶鮮葉代謝成像中展現出突破性優勢：其創新的光后電離機制使咖啡因檢測靈敏度較傳統DESI提升61倍（圖3B），清晰揭示了咖啡因沿葉脈富集并向葉肉延伸的合成梯度，精準驗證茶堿合成酶（TCS1）的嫩葉特異性表達規律。在多酚代謝網絡解析中，該技術成功捕獲兒茶素生物合成通路（含EC/EGCG等6類化合物），通過皮爾遜相關性分析鎖定沒食子酸及葡萄糖沒食子酸等關鍵中間體在葉脈區域的特異富集（圖3E），并基于空間分布特征證實兒茶素沒食子酰化修飾的酶促反應路徑（圖3F）。在廣譜檢測層面，DESI/PI同步實現了茶氨酸于葉柄樞紐區的運輸通道可視化及谷氨酸全域分布成像，尤其在負離子模式下將代謝物響應強度系統性提升10-20倍，徹底解決了傳統DESI對兒茶素合成關鍵分子（如沒食子酸）的漏檢問題。這種跨極性（正/負離子模式）、跨代謝通路的同步成像能力，確立了DESI/PI在解析植物代謝時空動態中的不可替代性。
圖3 (A)印跡DESI/PI正離子模式下檢測到的茶葉代表性代謝物質譜圖像。(B)印跡DESI/PI（紅色）與DESI（黑色）對茶葉進行背景扣除后的平均正離子質譜圖。(C)印跡DESI檢測到的茶葉代表性代謝物質譜圖像。(D)茶葉中脈及葉片區域EC/C、EGC/ GC、ECG/CG和GCG/EGCG的箱線圖及t檢驗結果。****表示P值< 0.0001。(E)通過印跡DESI/PI正離子模式獲得的茶葉25種已 鑒定代謝物空間分布的皮爾遜相關系數熱圖。(F)主要兒茶素的生物合成途徑，其中檢測到的代謝物以紅色高亮顯示
本研究開發了基于PTFE印跡轉移與DESI/PI質譜聯用的植物代謝物原位分析方法。該方法通過PTFE印跡完整保留組織代謝物空間分布，結合DESI/PI技術進行解吸電離協同：通過引入光后電離，DESI/PI顯著提升極性至非極性代謝物的電離效率。以鼠尾草、銀杏及茶葉為模型進行成像分析，結果表明：正離子模式下除覆蓋絕大多數DESI檢出化合物外，DESI/PI可顯著檢出萜類、黃酮類等次生代謝物；負離子模式中PI輔助使代謝物信號強度提升十倍以上。該技術成功解析鮮茶葉兒茶素生物合成網絡的空間構象，證實DESI/PI兼具廣譜覆蓋性、高靈敏度及跨極性檢測能力，為植物代謝原位可視化提供可靠方法學支撐。
